细胞中与蛋白质合成相关的RNA可以分为信使RNA(mRNA)、转运RNA(tRNA)和核糖体RNA(rRNA)三大类。不同组织总RNA提取的实质就是将细胞裂解,释放出RNA,并通过不同方式去除蛋白质、DNA等杂质,最终获得高纯度RNA产物的过程。获得纯度高、完整性好的RNA,对后续的实验至关重要。
核糖核酸(Ribonucleic Acid,简称RNA)是一种存在于生物细胞以及部分病毒、类病毒中的遗传信息载体,是由核糖核苷酸通过磷酸二酯键连接而成的长链聚合分子。这种聚合分子,在基因的编码、解码、调节和表达中具有多种生物学作用。与DNA一样,RNA组装成一条核苷酸链,但与DNA不同的是,绝大部分在自然界中发现的RNA是一条折叠在其自身上的单链,而不是一对双链。细胞有机体使用信使RNA(mRNA)来传达指导特定蛋白质合成的遗传信息(使用鸟嘌呤、尿嘧啶、腺嘌呤和胞嘧啶的含氮碱基,由字母G、U、A和C表示)。许多病毒使用RNA基因组编码其遗传信息。RNA包括mRNA(信使RNA)、rRNA(核糖体RNA),rRNA(核糖体RNA),miRNA(小RNA),lncRNA(长链非编码RNA),circRNA(环状RNA)。
以下实验流程为参考,请严格按照试剂盒的说明书操作
4°C 预冷离心机
将组织或细胞裂解液转移到 1.5毫升无RNA酶EP管中。置冰上,静置 5 分钟。
每管加入200ul氯仿,充分混合后冰上静置10分钟,使核蛋白复合物完全解离。
在 4°C 下以 13000 rpm离心 15 分钟。期间,取一新EP管,加入500ul异丙醇,冰上预冷。
离心后,将上层水相 (约500 ul) 转移到该新的 EP管中。
冰上静置,酒精沉淀10min。
离心, 13000 rpm, 10 分钟。
去除上清液。用 1ml 75% 乙醇洗涤 RNA 沉淀一次。
12000rpm离心 5 分钟。
去掉上清,风干或真空干燥 RNA 沉淀 5-10 分钟。
将 RNA 溶解在30-50ul DEPC 处理过的去离子水中(需根据RNA沉淀的量加水溶解)。
进行分光光度分析以确定样品浓度和纯度。
避免污染
为避免RNase等污染,可以在操作前仔细清洁实验平台、试剂盒、器皿和工具等,并使用经清洗的试剂和器皿。此外,应该尽可能快地进行样品提取,以减少RNA降解和污染的可能性。
明确目的和选择合适的方法
不同的样本类型有不同的组织结构和特征,因此需要根据实验目的和样本类型选择合适的RN提取方法。
优化样品破碎步骤
样品破碎对RNA提取至关重要。不同样品类型需要不同的破碎方法,如高压均质机、超声波等。在破碎过程中,需要注意破碎时间和功率控制,以避免过度破碎导致RNA的降解。细胞破碎方法:超声波法、高压均质法、玻璃珠法等都是常用的细胞破碎方法。
温度控制
RNA在高温下易于分解,因此在提取RNA时要控制好温度。在冷冻样品之前,通常建议在低温环境中培养细胞或收集组织,以最大程度地保护RNA。
RNA/DNA保存
RN应该储存在-80℃冰箱中,以避免降解和污染。在长期储存之前,建议进行浓缩,并将RNA用RNase-free水稀释至合适的浓度。
试剂
氯仿,苯酚,异丙醇溶液,无RNA酶水,75%乙醇。
仪器
移液枪,超净台,涡旋器,冷冻离心机
通过总RNA提取可获得高纯度及高质量的总RNA,可用于实时荧光定量PCR、Northern blot、microRNA检测、芯片分析, DNA文库构建,基因克隆等实验。
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